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水在新一代测序(NGS)中的应用

  新一代测序(NGS)彻底改变了基因组学研究,并且在临床中也起着至关重要的作用。 在评估新药物治疗方面,以 NGS 为基础 的检测也是越来越重要。同时也越来越多地用于筛选,诊断,癌症分子表征及其他疾病的研究,这些分子病理工具的发展导致了个 性化治疗和预防性治疗 .1,2 而实验室进行高通量测序需要依靠高品质的试剂以获得最佳结果。水是 NGS 工作流程中必不可少却经 常被忽视的试剂。从系统清洗到基因测序,NGS 工作流程中的各种环节都需要不同级别的水。

  讨论

  现如今各种 NGS 平台依赖于不同的化学过程和测序步骤,但大多数都遵循类似的实验流程(图 1)。 水质可能影响实验流程的每 一环节。

  Figure 1.NGS 流程和水质需求

  DNA 片段化

  高质量的测序文库对于获得可靠的 NGS 数据至关重要 3,重要的第一步是 DNA 片段化 如果使用声剪切或超声处理来分离 DNA, 对于水浴用水建议使用无颗粒的纯水(例如,Elix® 系统),因为杂质会影响转移到样品的能量效率。 应定期更换水以限制细菌生 长并降低样品污染的风险。

  核酸库制备

  水含有的污染物,即使非常微量也可能直接干扰 DNA 或与在文库制备期间进行的酶反应(例如终端修复,连接,PCR)。酶活性 可能受到水中痕量的有机分子(腐殖酸),离子或金属(镁,铁等)的影响。此外,核酸酶可能降解样品,也需要避免。再者,水 中如颗粒或细菌的污染可能会污染仪器或沉积在自动化液体处理系统中。因此,推荐使用不含核酸酶的超纯水(例如,来自装有Biopak® 的 Milli-Q® 系统)。

  对于文库定量和质量控制,会使用凝胶,芯片或毛细管电泳。在所有情况下,水质会影响带有电荷的样品的迁移,荧光检测也可能 被有机污染物干扰。因此,为了确保结果的可靠,应使用不含离子和有机物的超纯水(电阻率 18.2MΩ•cm; TOC 5ppb 以下), 用于缓冲液制备和毛细管凝胶,溶液稀释。

  Next-Generation Sequencing

  测序过程对任何核酸酶活性都非常敏感。 虽然核酸酶污染的影响在初始加载和校准期间可能不明显,但随着时间的推移,信号的 劣化会给实验带来灾难性的结果。 因此,推荐使用无核酸酶的超纯水,用于缓冲液的稀释和系统运行缓冲液的配制。

  • 基于荧光的 NGS

  NGS 平台在工程和测序化学方面有所不同,但大部分依赖于荧光检测。除了上述水中污染物外,必须避免痕量有机污染物,它 们可能会影响荧光检测。事实上,水中的有机污染物可以淬火或增加荧光信号,这两种情况都会产生错误的结果。

  • 离子半导体 NGS

  该测序技术通过检测核苷酸掺入过程中的质子释放 5,它不同于光学检测,而是通过精确的 pH 中的电荷变化来进行测量。该技 术对于不是由于 DNA 分子扩展而导致的任何 pH 变化非常敏感。仪器制造商特别建议使用新鲜纯化的超纯水确保 pH 接近 7。 这是因为储存中超纯水在与大气接触后会吸收二氧化碳并变成微酸性(图 2),会影响测序过程。对于这个原因,用于离子半导 体 NGS 检测的超纯水必须经过新鲜的纯化和保存,以免与大气接触。

  Figure 2. Absorption of carbon dioxide by ultrapure water. When ultrapure water is left in contact with the atmosphere, it absorbs carbon dioxide from the air, leading to the production of carbonic acid, carbonate and bicarbonate. The pH of water, initially at 7.0, may drop as low as 5.8.

  结论

  水是 NGS 中的重要试剂,其质量直接影响了测序结果的一致性和可靠性。设计优良和维护稳定的水纯化系统可以为实验室提供高 品质的水,以满足他们所有实验的需求。

  References

  1. I.A. Cree, Z. Deans, M.J.L. Ligtenberg, et al., Guidance for laboratories performing molecular pathology for cancer patients, J Clin Pathol (2014) 67:923-931.

  2. T.J.R. Harris, F. McCormick, The molecular pathology of cancer, Nat. Rev. Clin. Oncol. (2010) 7, 251–265.

  3. S.R. Head, H.K. Komori, S.A. LaMere et al., Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges, Biotechniques, (2014) 56(2):61-77.

  4. E. Riche, S. Mabic, Nuclease-free water at your fingertips, Merck Lab Water Application Note, 2017.

  5. E.R. Mardis, Next-Generation Sequencing Platforms, Annu. Rev. Anal. Chem. (2013) 6:287–303.

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